LINK TẢI LUẬN VĂN MIỄN PHÍ CHO AE KET-NOI
Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư của lá Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor)
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN..................................................................................................ii MỤC LỤC.......................................................................................................iii DANH MỤC HÌNH.........................................................................................v DANH MỤC BẢNG.......................................................................................vi KÝ HIỆU VIẾT TẮT....................................................................................vii LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về lá Xạ đen............................................................................. 3 1.1.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố. ..................................................... 3 1.1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp chất của cây xạ đen ............................................................................... 4 1.1.3. Tác dụng sinh học ............................................................................ 12 1.1.4. Một số bài thuốc y học cổ truyền: .................................................... 13
1.2. Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí. ........................................ 13 1.2.1. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM). .......................................... 13 1.2.2. Phương pháp sắc ký cột.................................................................... 17
1.3. Sơ bộ các phương phác xác định cấu trúc. ............................................. 19 1.3.1. Phổ khối lượng MS .......................................................................... 20 1.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR .................................................. 21 1.3.3. Phổ 1H-NMR .................................................................................... 22 1.3.4. Phổ 13C-NMR ................................................................................... 22 1.3.5. Phổ DEPT ......................................................................................... 23 1.3.6. Phổ 2D-NMR ................................................................................... 23
1.4. Giới thiệu một số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ................ 25
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................... 27
2.1. Mẫu thực vật ........................................................................................... 27
iv
2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất .................................................................. 28 2.2.1. công cụ và thiết bị chiết tách mẫu.................................................. 28 2.2.2. công cụ thiết bị xác định cấu trúc ................................................... 29 2.2.3. Hoá chất............................................................................................ 29 2.2.4.Dòng tếbào(celllines)...................................................................30
2.3. Chiết phân đoạn. ..................................................................................... 30 2.4. Phân lập một số hợp chất trong cây xạ đen. ........................................... 32 2.4.1. Phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 ................................................. 33 2.4.2. Phân lập hợp chất Ed 17.3................................................................ 35 2.4.3. Phân lập hợp chất Ed 11.4................................................................ 36 2.5. Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm .............................................. 37 2.5.1. Hợp chất Ed 3.2................................................................................37 2.5.2. Hợp chất Ed 5.5................................................................................37 2.5.3. Hợp chất Ed 17.3.............................................................................. 38 2.5.4. Hợp chất Ed 11.4.............................................................................. 38 2.6. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity)......................39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 42 3.1. Hợp chất 1: Ed 3.2 .................................................................................. 42 3.2. Hợp chất 2: Ed 5.5 .................................................................................. 44 3.3. Hợp chất 3: Ed 17.3 ................................................................................ 47 3.4. Hợp chất 4: Ed 11.4 ................................................................................ 50 3.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào......................................... 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 56 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 56 4.2. KIẾN NGHỊ............................................................................................ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 58 PHỤ LỤC PHỔ ............................................................................................. 62
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor ........................................................... 3 Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu ............................................. 8 Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ....................................... 9 Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ..................................... 10 Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu ........................................... 11 Hình 1.6: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ..................................... 12 Hình 2.1. Mẫu Xạ đen thu được tại Hòa Bình ................................................ 27 Hình 2.2. Mẫu tiêu bản Xạ đen đã được giám định ........................................ 28 Hình 2.3. Sơ đồ chiết phân đoạn, phân lập cao xạ đen ................................... 32 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 ...................................... 34 Hình 2.5. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 17.3 .................................................... 35 Hình 2.6. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 11.4 .................................................... 36 Hình 3.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 3.2 ................ 42 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 5.5 ................ 44 Hình 3.3. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 5.5 ............... 45 Hình 3.4. Phổ DEPT của hợp chất Ed 5.5....................................................... 45 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 17.3 .............. 47 Hình 3.6. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 17.3 ............. 48 Hình 3.7. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 11.4 .............. 50 Hình 3.8. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 11.4 ............. 51 Hình 3.9. Phổ hai chiều HSQC của hợp chất Ed 11.4 .................................... 52 Hình 3.10. Phổ hai chiều HMBC của hợp chất Ed 11.4 ................................. 52
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn Gram dương Gram âm................................................................................................. 5 Bảng 3.1. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR của Ed 3.2 với số liệu phổ 1H- NMR của caffeic acid ..................................................................................... 43 Bảng 3.2. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 5.5 với số liệu phổ 1H-NMR của Methyl caffedte .......................................................... 46 Bảng 3.3. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 17.3 với số liệu phổ 1H-NMR của Rosmarinic acid ......................................................... 49 Bảng 3.4. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 11.4 với số liệu phổ 1H-NMR của Methyl rosmarinate .................................................... 53 Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào .................................................... 54
Ký hiệu
Ed 13C-NMR
1H-NMR DEPT
HSQC
δ ppm
s
d
dd Rf Hep-G2 LU-1
MCF-7
HeLa W D H M E A
KÝ HIỆU VIẾT TẮT Tiếng Anh
Tiếng Việt
vii
Ehretia asperula Zoll. & Mor Carbon (13) Nucleaedr Magnetic Resonance
Hydro (1) Nucleaedr Magnetic Resonance
Distortionless Enhancement by
Heteronucleaedr Single Quantum Correlation Chemical shift
Part per million
Singlet
Doublet
Double of doublet
retardation factors
Human hepatocellular carcinoma Human lung adenocarcinoma Human breaedst adenocarcinoma
HeLa cervical cancer cells Water
Dichloromethane
n-Hexane
Methanol
Ethyl acetate
Acetone
Xạ đen
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1)
Phổ DEPT
Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết
Độ chuyển dịch hóa học
Một phần triệu
Phát triển chậm
Tế bào Ung thư gan Tế bào Ung thư phổi
Tế bào Ung thư vú
Tế bào Ung thư cổ tử cung HeLa nước
HMBC
Polarization Transfer Heteronucleaedr Multiple Bond Coherence
Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết
1
LỜI MỞ ĐẦU
Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại. Giá trị của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà còn có thể dùng làm nguyên mẫu hay cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển nhiều dược phẩm mới. Việt Nam được đánh giá có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu này nhờ vào nền y học cổ truyền lâu đời. Theo thống kê ở Việt Nam hiện có hơn 13000 loài thực vật trong đó khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc. Đây là một lợi thế để chúng ta khai thác nguồn dược liệu này phục vụ cho cuộc sống. Các nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học là con đường ngắn nhất và hiệu quả nhất để tìm kiếm có chọn lọc các hoạt chất từ nguồn tài nguyên thiên nhiên.
Ung thư được coi là một trong những căn bệnh nan y do khả năng kháng thuốc, gây di căn mạnh của các tế bào ung thư. Chính vì thế, việc phát triển những loại dược phẩm mới đặc trị hay ngăn ngừa quá trình di căn ung thư đang là vấn đề cấp thiết của y học hiện đại. Cây xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor, họ Vòi Voi (Boraginaceae). Xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Sơn La, Hà Nam, Quảng Ninh, Hòa Bình, chúng mọc tự nhiên trong rừng. Xạ đen là cây thân gỗ mọc leo thành bụi, nhánh non tròn, không lông. Dài trung bình 5-7m có khi tới hàng chục mét, thân già vỏ nâu đốm trắng, chồi và lá non có màu tím đỏ. Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về cây Xạ đen như: Lê Thế Trung và cộng sự (1999) đã nghiên cứu về khả năng chữa ung thư của cây xạ đen Hòa Bình; Nguyễn Huy Cường (2008) nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học cây xạ đen.
2
Dựa trên kết quả sàng lọc hoạt tính trên tế bào ung thư cho thấy cao chiết lá xạ đen có tác dụng diệt tế bào ung thư mạnh. Chính vì vậy việc lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư của lá Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor)” là một việc cấp thiết có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn.
Đề tài được thực hiện với các mục tiêu chính sau:
Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ lá xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor) và đánh giá được tác dụng diệt tế bào ung thư của chúng.
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
Nghiên cứu về thành phần hóa học:
- Phân lập các chất sạch
- Xác định cấu trúc các chất phân lập được. Nghiên cứu về tác dụng sinh học:
- Khảo sát khả năng gây độc tế bào của các hợp chất đối với bốn dòng tế bào ung thư: Hep-G2, LU-1, MCF-7, HeLa.
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về lá Xạ đen.
1.1.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố.
Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor
Xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor thuộc họ Vòi voi cây thân gỗ, bụi hay cây thảo có hình trụ, lá đơn mọc so le, không có lá kèm, trên thân và cả lá bao phủ những lông cứng hay mềm. Hoa hầu như luôn đều, đài hợp nhiều hay ít, tồn tại trên quả, sau đó lớn lên. Nhị luôn dính với ống tràng, nhưng có phần chỉ nhị hay lớn hay nhỏ rời nhau. Nhụy gồm 2 lá noãn và lúc đầu là bầu trên, 2 ô, với 2 noãn trong mỗi ô. Nhưng ngay sau đó, ở đa số các cây họ Vòi voi, mỗi ô của bầu lại được sớm phân chia bằng một vách ngăn giả. Do đó bầu nhụy trở thành có 4 ô chứa mỗi ô một noãn. Do sự phát triển của các vách trong mỗi ô của bầu làm cho bầu chở lên có 4 thùy, còn vòi nhụy đâm ra ở chỗ lõm giữa 4 thùy của bầu đó. Vòi nhụy thường mag ở phía trên một đầu nhụy, và đầu nhụy hơi lõm, đôi khi cũng có 2 đầu nhụy. Khi quả chín thì các thùy của bầu
4
tách nhau ra thành 4 quả hạch nhỏ riêng biệt có một hạt. Hạt thường kông
có nội nhũ hay rất ít khi có nội nhũ. [1]
Ở Việt Nam Ehretia asperula Zoll. & Mor còn được gọi là Dót, Thân cây gỗ nhỏ cao đến 1m. Lá có phiến bầu dục thon, 4 – 10 x 2-5cm, đáy tròn, mép có răng hay nguyên, gân phụ 6 cặp, cuống dài 1,7cm. Chùm sim ở đầu cành, có vài lá nhỏ ở đáy. Hoa ống ngắn, bộ nhị 5 bầu không lông, quả tròn,
to 4-5mm, có 4 cạnh, có 4 hột. Loài phân bố chủ yếu ở Indonesia và Việt Nam (Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hòa Bình). [1]
Về phân bố, họ Vòi voi là một họ khá lớn phân bố rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới, nhưng chủ yếu ở vùng ôn đới phía bắc, đặc biệt là vùng Địa Trung Hải, Tây và Trung Á và Thái Bình Dương thuộc Bắc Mỹ, ở nước ta loài mọc khắp cả nước. Ehretia asperula Zoll. & Mor phân bố chủ yếu ở Indonesia và ở Việt Nam cây phân bố chủ yếu ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hòa Bình.
Sơ lược về chi Ehretia
Cây bụi hay gỗ, lá nguyên hay có răng cưa ở mép, cụm hoa ngù hay chùy, đài chia làm 5 phần, tràng hoa hình ống hay hình chuông, hiếm khi hình phễu, hoa mẫu 5 chỉ nhị thò ra, bao phấn hình trứng hay thon dài. Bầu nhụy hình trứng, chia làm 2 ngăn, mỗi ngăn chứa 2 noãn. Vòi nhụy chẻ 2, có 2 đầu
nhụy, hình tròn hay thon dài. Quả hạch màu vàng, cam, hay đỏ nhạt, hình cầu, nhẵn, khi chín vỏ quả trong chia làm 2 thùy mỗi thùy có 2 hạt hay chia làm 4 thùy mỗi thùy có 1 hạt, hạt cứng.[5]
1.1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp chất của cây xạ đen
Xạ đen được biết đến bởi mang trong mình nhiều hoạt tính sinh học quý giá như điều trị mụn nhọt, ung thư, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư. Có tác dụng thông
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn Gram dương Gram âm
n-Hexane - - - - EtOAc ---- MeOH 2--- Nước 7---
5
kinh lợi niệu, cây dùng trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh lậu. Điều trị ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch, tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Ở Việt Nam cũng như trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Xạ đen nhằm khai thác triệt để tiềm năng y học của cây
thuốc này. Dưới đây là một số công trình khoa học, nghiên cứu trong và ngoài nước đối với cây xạ đen.
Năm 2012 nhóm nghiên cứu Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên, Nguyễn Thị Yến, Ngô Thị Trang thuộc khoa Sinh học của trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội tiến hành thử hoạt tính sinh học của cây xạ đen bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Họ thử nghiệm bốn loại dịch chiết của xạ đen là dịch chiết n-Hexane, dịch chiết EtOAc, dịch chết MeOH và dịch chiết nước trên vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis và Sarcina sp), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC 25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). Kết quả hoạt tính sinh học được tổng hợp ở (Bảng 1.1) [3].
D-d (mm) Dịch chiết
B. subtilis
Sarcina sp.
E. coli
P. aeruginosa
6
Trong luận án tiến sĩ hóa học của Nguyễn Huy Cường năm 2008 với đề tài Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học cây Xạ đen[2, 10], đã phân lập được một số hợp chất trong cây xạ đen và khảo sát hoạt tính sinh học của chúng trên một vài dòng tế bào ung thư. Trong luận án có bốn chất khung friedelan: 3α-friedelanol (1), 3-friedelanon (2), D:A-friedo- olednon-3,21-dion (3), canophyllol (4); năm hợp chất có khung lupan là: lup- 20-en-3β-ol (5), lup-12-en-3β-ol (6), lup-20-en-3-ol (lupenon, 7), lup-12-en-3- on (8), lup-20-en-3β, 11β-diol (9); và hai hợp chất khác là clionasterol (10), axit glucosyringic (11). Kết quả thử hoạt tính trên hai tế bào ung thư gan (Hep- G2) và ung thư phổi (Lu-1) cho thấy các hợp chất thử (1, 2, 3 và 9) đều không thể hiện hoạt tính đối với hai dòng tế bào ung thư này. Một số hợp chất của xạ đen có cấu trúc như sau:
Kết quả thử nghiệm thấy methyl caffedte và methyl rosmarinate đều thể hiện hoạt tính tốt với các tế bào ung thư Hep-G2, HeLa và MCF-7, còn caffeic acid và rosmarinic acid không thể hiện hoạt tính với cả bốn tế bào ung thư thử nghiệm. Caffeic acid không có khả năng gây độc tế bào ung thư nhưng khi thay thế nhóm OH của gốc axit bằng nhóm methyl ester thì khả năng gây độc tế bào ung thư tăng lên đáng kể điều này cho thấy khả năng kháng ung thư của methyl caffedte có thể phụ thuộc vào nhóm methyl ester
này. Đối với hai hợp chất methyl rosmarinate và rosmarinic acid cũng có thể do nguyên nhân trên. Cả bốn hợp chất này đều không thể hiện hoạt tính với tế bào ung thư LU-1. Trong hai hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc, methyl caffedte có hoạt tính sinh học tốt hơn hẳn so với hợp chất methyl rosmarinate điều này có thể do cấu trúc của methyl caffedte phù hợp hơn cấu trúc của methyl rosmarinate. Kết quả này gợi mở cho những nghên cứu tiếp theo đối với cả bốn hợp chất này.
Một số nghiên cứu của Takahashi K và cộng sự vào năm 2010 cho thấy ngoài hoạt tính trên của methyl caffedte nó còn có khả năng ức chế vừa phải
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư của lá Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor)
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN..................................................................................................ii MỤC LỤC.......................................................................................................iii DANH MỤC HÌNH.........................................................................................v DANH MỤC BẢNG.......................................................................................vi KÝ HIỆU VIẾT TẮT....................................................................................vii LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3
1.1. Giới thiệu về lá Xạ đen............................................................................. 3 1.1.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố. ..................................................... 3 1.1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp chất của cây xạ đen ............................................................................... 4 1.1.3. Tác dụng sinh học ............................................................................ 12 1.1.4. Một số bài thuốc y học cổ truyền: .................................................... 13
1.2. Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí. ........................................ 13 1.2.1. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM). .......................................... 13 1.2.2. Phương pháp sắc ký cột.................................................................... 17
1.3. Sơ bộ các phương phác xác định cấu trúc. ............................................. 19 1.3.1. Phổ khối lượng MS .......................................................................... 20 1.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR .................................................. 21 1.3.3. Phổ 1H-NMR .................................................................................... 22 1.3.4. Phổ 13C-NMR ................................................................................... 22 1.3.5. Phổ DEPT ......................................................................................... 23 1.3.6. Phổ 2D-NMR ................................................................................... 23
1.4. Giới thiệu một số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ................ 25
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................... 27
2.1. Mẫu thực vật ........................................................................................... 27
iv
2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất .................................................................. 28 2.2.1. công cụ và thiết bị chiết tách mẫu.................................................. 28 2.2.2. công cụ thiết bị xác định cấu trúc ................................................... 29 2.2.3. Hoá chất............................................................................................ 29 2.2.4.Dòng tếbào(celllines)...................................................................30
2.3. Chiết phân đoạn. ..................................................................................... 30 2.4. Phân lập một số hợp chất trong cây xạ đen. ........................................... 32 2.4.1. Phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 ................................................. 33 2.4.2. Phân lập hợp chất Ed 17.3................................................................ 35 2.4.3. Phân lập hợp chất Ed 11.4................................................................ 36 2.5. Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm .............................................. 37 2.5.1. Hợp chất Ed 3.2................................................................................37 2.5.2. Hợp chất Ed 5.5................................................................................37 2.5.3. Hợp chất Ed 17.3.............................................................................. 38 2.5.4. Hợp chất Ed 11.4.............................................................................. 38 2.6. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity)......................39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 42 3.1. Hợp chất 1: Ed 3.2 .................................................................................. 42 3.2. Hợp chất 2: Ed 5.5 .................................................................................. 44 3.3. Hợp chất 3: Ed 17.3 ................................................................................ 47 3.4. Hợp chất 4: Ed 11.4 ................................................................................ 50 3.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào......................................... 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 56 4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 56 4.2. KIẾN NGHỊ............................................................................................ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 58 PHỤ LỤC PHỔ ............................................................................................. 62
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor ........................................................... 3 Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu ............................................. 8 Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ....................................... 9 Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ..................................... 10 Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu ........................................... 11 Hình 1.6: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ..................................... 12 Hình 2.1. Mẫu Xạ đen thu được tại Hòa Bình ................................................ 27 Hình 2.2. Mẫu tiêu bản Xạ đen đã được giám định ........................................ 28 Hình 2.3. Sơ đồ chiết phân đoạn, phân lập cao xạ đen ................................... 32 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 ...................................... 34 Hình 2.5. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 17.3 .................................................... 35 Hình 2.6. Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 11.4 .................................................... 36 Hình 3.1. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 3.2 ................ 42 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 5.5 ................ 44 Hình 3.3. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 5.5 ............... 45 Hình 3.4. Phổ DEPT của hợp chất Ed 5.5....................................................... 45 Hình 3.5. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 17.3 .............. 47 Hình 3.6. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 17.3 ............. 48 Hình 3.7. Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) của hợp chất Ed 11.4 .............. 50 Hình 3.8. Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) của hợp chất Ed 11.4 ............. 51 Hình 3.9. Phổ hai chiều HSQC của hợp chất Ed 11.4 .................................... 52 Hình 3.10. Phổ hai chiều HMBC của hợp chất Ed 11.4 ................................. 52
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn Gram dương Gram âm................................................................................................. 5 Bảng 3.1. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR của Ed 3.2 với số liệu phổ 1H- NMR của caffeic acid ..................................................................................... 43 Bảng 3.2. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 5.5 với số liệu phổ 1H-NMR của Methyl caffedte .......................................................... 46 Bảng 3.3. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 17.3 với số liệu phổ 1H-NMR của Rosmarinic acid ......................................................... 49 Bảng 3.4. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 11.4 với số liệu phổ 1H-NMR của Methyl rosmarinate .................................................... 53 Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào .................................................... 54
Ký hiệu
Ed 13C-NMR
1H-NMR DEPT
HSQC
δ ppm
s
d
dd Rf Hep-G2 LU-1
MCF-7
HeLa W D H M E A
KÝ HIỆU VIẾT TẮT Tiếng Anh
Tiếng Việt
vii
Ehretia asperula Zoll. & Mor Carbon (13) Nucleaedr Magnetic Resonance
Hydro (1) Nucleaedr Magnetic Resonance
Distortionless Enhancement by
Heteronucleaedr Single Quantum Correlation Chemical shift
Part per million
Singlet
Doublet
Double of doublet
retardation factors
Human hepatocellular carcinoma Human lung adenocarcinoma Human breaedst adenocarcinoma
HeLa cervical cancer cells Water
Dichloromethane
n-Hexane
Methanol
Ethyl acetate
Acetone
Xạ đen
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1)
Phổ DEPT
Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết
Độ chuyển dịch hóa học
Một phần triệu
Phát triển chậm
Tế bào Ung thư gan Tế bào Ung thư phổi
Tế bào Ung thư vú
Tế bào Ung thư cổ tử cung HeLa nước
HMBC
Polarization Transfer Heteronucleaedr Multiple Bond Coherence
Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết
1
LỜI MỞ ĐẦU
Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại. Giá trị của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà còn có thể dùng làm nguyên mẫu hay cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển nhiều dược phẩm mới. Việt Nam được đánh giá có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu này nhờ vào nền y học cổ truyền lâu đời. Theo thống kê ở Việt Nam hiện có hơn 13000 loài thực vật trong đó khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc. Đây là một lợi thế để chúng ta khai thác nguồn dược liệu này phục vụ cho cuộc sống. Các nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học là con đường ngắn nhất và hiệu quả nhất để tìm kiếm có chọn lọc các hoạt chất từ nguồn tài nguyên thiên nhiên.
Ung thư được coi là một trong những căn bệnh nan y do khả năng kháng thuốc, gây di căn mạnh của các tế bào ung thư. Chính vì thế, việc phát triển những loại dược phẩm mới đặc trị hay ngăn ngừa quá trình di căn ung thư đang là vấn đề cấp thiết của y học hiện đại. Cây xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor, họ Vòi Voi (Boraginaceae). Xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Sơn La, Hà Nam, Quảng Ninh, Hòa Bình, chúng mọc tự nhiên trong rừng. Xạ đen là cây thân gỗ mọc leo thành bụi, nhánh non tròn, không lông. Dài trung bình 5-7m có khi tới hàng chục mét, thân già vỏ nâu đốm trắng, chồi và lá non có màu tím đỏ. Tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về cây Xạ đen như: Lê Thế Trung và cộng sự (1999) đã nghiên cứu về khả năng chữa ung thư của cây xạ đen Hòa Bình; Nguyễn Huy Cường (2008) nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học cây xạ đen.
2
Dựa trên kết quả sàng lọc hoạt tính trên tế bào ung thư cho thấy cao chiết lá xạ đen có tác dụng diệt tế bào ung thư mạnh. Chính vì vậy việc lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư của lá Xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor)” là một việc cấp thiết có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn.
Đề tài được thực hiện với các mục tiêu chính sau:
Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ lá xạ đen (Ehretia asperula Zoll. & Mor) và đánh giá được tác dụng diệt tế bào ung thư của chúng.
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
Nghiên cứu về thành phần hóa học:
- Phân lập các chất sạch
- Xác định cấu trúc các chất phân lập được. Nghiên cứu về tác dụng sinh học:
- Khảo sát khả năng gây độc tế bào của các hợp chất đối với bốn dòng tế bào ung thư: Hep-G2, LU-1, MCF-7, HeLa.
3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về lá Xạ đen.
1.1.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố.
Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor
Xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor thuộc họ Vòi voi cây thân gỗ, bụi hay cây thảo có hình trụ, lá đơn mọc so le, không có lá kèm, trên thân và cả lá bao phủ những lông cứng hay mềm. Hoa hầu như luôn đều, đài hợp nhiều hay ít, tồn tại trên quả, sau đó lớn lên. Nhị luôn dính với ống tràng, nhưng có phần chỉ nhị hay lớn hay nhỏ rời nhau. Nhụy gồm 2 lá noãn và lúc đầu là bầu trên, 2 ô, với 2 noãn trong mỗi ô. Nhưng ngay sau đó, ở đa số các cây họ Vòi voi, mỗi ô của bầu lại được sớm phân chia bằng một vách ngăn giả. Do đó bầu nhụy trở thành có 4 ô chứa mỗi ô một noãn. Do sự phát triển của các vách trong mỗi ô của bầu làm cho bầu chở lên có 4 thùy, còn vòi nhụy đâm ra ở chỗ lõm giữa 4 thùy của bầu đó. Vòi nhụy thường mag ở phía trên một đầu nhụy, và đầu nhụy hơi lõm, đôi khi cũng có 2 đầu nhụy. Khi quả chín thì các thùy của bầu
4
tách nhau ra thành 4 quả hạch nhỏ riêng biệt có một hạt. Hạt thường kông
có nội nhũ hay rất ít khi có nội nhũ. [1]
Ở Việt Nam Ehretia asperula Zoll. & Mor còn được gọi là Dót, Thân cây gỗ nhỏ cao đến 1m. Lá có phiến bầu dục thon, 4 – 10 x 2-5cm, đáy tròn, mép có răng hay nguyên, gân phụ 6 cặp, cuống dài 1,7cm. Chùm sim ở đầu cành, có vài lá nhỏ ở đáy. Hoa ống ngắn, bộ nhị 5 bầu không lông, quả tròn,
to 4-5mm, có 4 cạnh, có 4 hột. Loài phân bố chủ yếu ở Indonesia và Việt Nam (Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hòa Bình). [1]
Về phân bố, họ Vòi voi là một họ khá lớn phân bố rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới, nhưng chủ yếu ở vùng ôn đới phía bắc, đặc biệt là vùng Địa Trung Hải, Tây và Trung Á và Thái Bình Dương thuộc Bắc Mỹ, ở nước ta loài mọc khắp cả nước. Ehretia asperula Zoll. & Mor phân bố chủ yếu ở Indonesia và ở Việt Nam cây phân bố chủ yếu ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Nam, Hà Nội, Hòa Bình.
Sơ lược về chi Ehretia
Cây bụi hay gỗ, lá nguyên hay có răng cưa ở mép, cụm hoa ngù hay chùy, đài chia làm 5 phần, tràng hoa hình ống hay hình chuông, hiếm khi hình phễu, hoa mẫu 5 chỉ nhị thò ra, bao phấn hình trứng hay thon dài. Bầu nhụy hình trứng, chia làm 2 ngăn, mỗi ngăn chứa 2 noãn. Vòi nhụy chẻ 2, có 2 đầu
nhụy, hình tròn hay thon dài. Quả hạch màu vàng, cam, hay đỏ nhạt, hình cầu, nhẵn, khi chín vỏ quả trong chia làm 2 thùy mỗi thùy có 2 hạt hay chia làm 4 thùy mỗi thùy có 1 hạt, hạt cứng.[5]
1.1.2. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các hợp chất của cây xạ đen
Xạ đen được biết đến bởi mang trong mình nhiều hoạt tính sinh học quý giá như điều trị mụn nhọt, ung thư, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong xơ gan cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư. Có tác dụng thông
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn Gram dương Gram âm
n-Hexane - - - - EtOAc ---- MeOH 2--- Nước 7---
5
kinh lợi niệu, cây dùng trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh lậu. Điều trị ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch, tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Ở Việt Nam cũng như trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Xạ đen nhằm khai thác triệt để tiềm năng y học của cây
thuốc này. Dưới đây là một số công trình khoa học, nghiên cứu trong và ngoài nước đối với cây xạ đen.
Năm 2012 nhóm nghiên cứu Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên, Nguyễn Thị Yến, Ngô Thị Trang thuộc khoa Sinh học của trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội tiến hành thử hoạt tính sinh học của cây xạ đen bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Họ thử nghiệm bốn loại dịch chiết của xạ đen là dịch chiết n-Hexane, dịch chiết EtOAc, dịch chết MeOH và dịch chiết nước trên vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis và Sarcina sp), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC 25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). Kết quả hoạt tính sinh học được tổng hợp ở (Bảng 1.1) [3].
D-d (mm) Dịch chiết
B. subtilis
Sarcina sp.
E. coli
P. aeruginosa
6
Trong luận án tiến sĩ hóa học của Nguyễn Huy Cường năm 2008 với đề tài Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học cây Xạ đen[2, 10], đã phân lập được một số hợp chất trong cây xạ đen và khảo sát hoạt tính sinh học của chúng trên một vài dòng tế bào ung thư. Trong luận án có bốn chất khung friedelan: 3α-friedelanol (1), 3-friedelanon (2), D:A-friedo- olednon-3,21-dion (3), canophyllol (4); năm hợp chất có khung lupan là: lup- 20-en-3β-ol (5), lup-12-en-3β-ol (6), lup-20-en-3-ol (lupenon, 7), lup-12-en-3- on (8), lup-20-en-3β, 11β-diol (9); và hai hợp chất khác là clionasterol (10), axit glucosyringic (11). Kết quả thử hoạt tính trên hai tế bào ung thư gan (Hep- G2) và ung thư phổi (Lu-1) cho thấy các hợp chất thử (1, 2, 3 và 9) đều không thể hiện hoạt tính đối với hai dòng tế bào ung thư này. Một số hợp chất của xạ đen có cấu trúc như sau:
Kết quả thử nghiệm thấy methyl caffedte và methyl rosmarinate đều thể hiện hoạt tính tốt với các tế bào ung thư Hep-G2, HeLa và MCF-7, còn caffeic acid và rosmarinic acid không thể hiện hoạt tính với cả bốn tế bào ung thư thử nghiệm. Caffeic acid không có khả năng gây độc tế bào ung thư nhưng khi thay thế nhóm OH của gốc axit bằng nhóm methyl ester thì khả năng gây độc tế bào ung thư tăng lên đáng kể điều này cho thấy khả năng kháng ung thư của methyl caffedte có thể phụ thuộc vào nhóm methyl ester
này. Đối với hai hợp chất methyl rosmarinate và rosmarinic acid cũng có thể do nguyên nhân trên. Cả bốn hợp chất này đều không thể hiện hoạt tính với tế bào ung thư LU-1. Trong hai hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc, methyl caffedte có hoạt tính sinh học tốt hơn hẳn so với hợp chất methyl rosmarinate điều này có thể do cấu trúc của methyl caffedte phù hợp hơn cấu trúc của methyl rosmarinate. Kết quả này gợi mở cho những nghên cứu tiếp theo đối với cả bốn hợp chất này.
Một số nghiên cứu của Takahashi K và cộng sự vào năm 2010 cho thấy ngoài hoạt tính trên của methyl caffedte nó còn có khả năng ức chế vừa phải
Do Drive thay đổi chính sách, nên một số link cũ yêu cầu duyệt download. các bạn chỉ cần làm theo hướng dẫn.
Password giải nén nếu cần: ket-noi.com | Bấm trực tiếp vào Link để tải:
You must be registered for see links